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你知道PCR引物設(shè)計原則是什么嗎?

更新時間:2024-04-09點(diǎn)擊次數(shù):2479

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。PCR中通常需要兩種引物。一種與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ), 另—種與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,因此,PCR的首要任務(wù)就是引物設(shè)計。引物設(shè)計的好壞,直接影響了PCR的結(jié)果。成功的PCR反應(yīng)既要高效,又要特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。那么PCR引物設(shè)計的原則有哪些呢?讓我們一起來看看吧!

圖片1.png


引物設(shè)計的目的是在兩個目標(biāo)之間取得平衡:擴(kuò)增特異性和效率。因此,引物的設(shè)計需要遵循以下原則

一、引物長度要適宜

一般,引物的長度為15-23bp,常用的長度為18-21bp。過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq 酶進(jìn)行反應(yīng)。過短則特異性差。

二、引物GC含量要適宜

1.引物3'端的堿基一般不用A,因為A在錯誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對比較高, 而其它三種堿基的錯誤引發(fā)效率相對小一些。

2.3'端防止連續(xù)三個CG,引物的GC含量一般為45-55%,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。

3.上下游引物的GC含量不能相差太大。

三、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列

堿基要隨機(jī)分布,且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體,從而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。



四、引物5'端可以修飾,3'端不可修飾

1引物的5' 端決定著PCR產(chǎn)物的長度,它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括:加酶切位點(diǎn),加標(biāo)記熒光,引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列;引入啟動子序列等。

2引物的延伸是從3'端開始的,不能進(jìn)行任何修飾。

3在引物的5`端連接一對限制酶的識別序列,這樣便于目的基因連接到載體上。

圖片4.png五、退火溫度要適宜

退火溫度高,擴(kuò)增特異性強(qiáng);退火溫度低,擴(kuò)增效率高。

原因:如果引物堿基數(shù)較少,可以適當(dāng)提高退火溫度,這樣可以使PCR的特異性增加;如果堿基數(shù)較多,那么可以適當(dāng)減低退火溫度,使DNA雙鏈結(jié)合。一對引物的退火溫度相差4℃~6℃不會影響PCR的產(chǎn)率,但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的。

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